实验报告-不同因素对酶的影响

专业: 实验报告 姓名: 学号: 日期: 地点: 课程名称: 生物化学实验(甲) 指导老师: 成绩: 实验名称: 酶的基本性质实验——底物专一性剂、激活剂和抑制、最适温度 实验类型: 分离鉴定实验 一、实验目的和要求(必填) 三、主要仪器设备(必填) 五、实验数据记录和处理 七、讨论、心得 同组学生姓名: 二、实验内容和原理(必填) 四、操作方法和实验步骤 六、实验结果与分析(必填) Ⅰ.酶的基本性质——底物专一性 一、实验目的和要求 装 订 线 1. 了解酶的专一性。

2. 掌握验证酶的专一性的基本原理及方法。

3. 学会排除干扰因素,设计 酶学实验。

二、实验基本原理 酶是一种具有催化功能的蛋白质。

酶蛋白结构决定了酶的功能——酶的高效性,酶催化的 反应(酶促反应)要比相应的没有催化剂的反应快 103-1017 倍。

酶催化作用的一个重要特 点是具有高度的底物专一性, 即一种酶只能对某一种底物或一类底物起催化作用, 对其他底物无 催化反应。

根据各种酶对底物的选择程度不同,它们的专一性可以分为下列几种: 1.相对专一性 绝对专一性: 一种酶能够催化一类具有相同化学键或基团的物质进行某种类型的反应。

2. 有些酶对底物的要求非常严格只作用于一种底物, 而不作用于任何其他物质。

有些酶只有作用于底物 如脲酶只能催化尿素进行水解而生成二氧化碳和氨。

如麦芽糖酶只作用于麦芽糖而不作用其它双 糖,淀粉酶只作用于淀粉,而不作用于纤维素。

3.立体异构专一性 用于 L-型的糖。

的立体异构物中的一种,而对另一种则全无作用。

如酵母中的糖酶类只作用于 D-型糖而不能作 本实验以唾液淀粉酶、蔗糖酶对淀粉、蔗糖水解反应的催化作用来观察酶 的专一性。

采用 Benedict 试剂检测反应产物。

Benedict 试剂是碱性硫酸铜溶液,具有一定的氧化能力,能与还原性糖的半缩醛羟基发生 氧化还原反应,生成砖红色氧化亚铜沉淀。

CuSO4+ 2NaOH (砖红色或黄色) + 2H2O + 糖的氧化产物 淀粉被淀粉酶水解,产物为葡萄糖;蔗糖和棉子糖被蔗糖酶 Na2CO3+ 2H2O 2NaOH + H2CO3 2Cu(OH)2 Cu2O Cu(OH)2+ Na2SO4 还原糖(—CHO or —C=O)+ 在分子结构上,淀粉几乎没有,而蔗糖、棉子糖全无半缩醛基,它们均无还原性,因此它们 与 Benedict 试剂无呈色反应。

水解,其产物为果糖和葡萄糖,它们都为具有自由半缩醛羟基的还原糖,与 Benedict 试剂共热, 即产生红棕色 Cu2O 沉淀。

本实验以此颜色反应观察淀粉酶、蔗糖酶对淀粉和蔗糖的水解作用。

三、实验材料与试剂 1、 实验材料⑴ 蔗糖酶(样品Ⅳ) ; ⑵ 新鲜唾液 (含唾液淀粉酶) ; 2、 实验试剂⑴ 蔗糖酶液 糖酶液(样品Ⅳ)加蒸馏水适当稀释,备用;⑵ 唾液淀粉酶液(学生自制) 蔗 取 0.5mL 唾液 至 25ml 量筒中, 用蒸馏水 (稀释) 到 25ml, 用棉花过滤备用。

唾液稀倍数因人而异, 可稀释 50~

图1

400 倍,甚至更高;⑶ 5%蔗糖(A.R.)溶液;⑷ 0.5%淀粉溶液(含 0.3%NaCl) ;⑸ Benedict 试剂 ;四、实验器材与仪器 1.漏斗, 2.脱脂棉花; 五、实验操作方法和步骤 ㈠ 检查试剂 取 3 支试管,按下表操作: 3.恒温水浴(37℃,100℃) ; 4.量筒;5.试管;6.烧杯;7.吸量管。

注:1、检查目的:试剂是否有干扰因素存在。

2、也可对蔗糖酶液、唾液淀粉酶液进行检查是否 也有干扰因素存在,请自己设计。

㈡淀粉酶的专一性 取三支试管,按下表操作: 注:可增加一组唾液淀 粉酶液 经 100℃加热 3min 处理后的样品对照组。

㈢蔗糖酶的专一性取三支试管,按下表操作: 注:可增加一组蔗糖酶液 经 100℃加热 3min 处理后的样品对照组。

六、结果分析讨论 各试管观察结果依次是: (一):1 号蓝绿色,2 号蓝色, 3 号蓝色

图2

Benedict 试剂是碱性硫酸铜溶液,具有一定的氧化能力,能与还原性糖的半缩醛羟基发生 氧化还原反应,生成砖红色氧化亚铜沉淀。

3 只试管都为蓝色说明几只试管中都没有果糖和葡萄 糖,说明在不加酶时,淀粉和蔗糖不易水解。

试剂无干扰因素的存在。

(1 号试管是蓝绿色可能 是因为有少部分的淀粉水解) (二):1 号土黄色,2 号黄绿色,3 号蓝色 加入唾液淀粉酶,1 号试管底物是淀粉,所以很容易水解成葡萄糖,与 Benedict 试剂共热, 即产生红棕色 Cu2O 沉淀。

所以 1 号颜色变化比较大。

(2 号可能是因为蔗糖在 37℃恒温水浴中也 有少部分水解,所以颜色变化,但变化不明显。

)总的来看可以看出唾液淀粉酶只对淀粉有催化 活性,不能催化蔗糖水解,具有对淀粉的底物专一性。

3 号是对照。

(三):1 号蓝色, 2 号红棕色,3 号蓝色 加入蔗糖酶,2 号试管底物是蔗糖,所以很容易水解成果糖和葡萄糖,与 Benedict 试剂共 热,即产生红棕色 Cu2O 沉淀。

所以 2 号颜色变化比较大。

(1 号可能是因为淀粉在 37℃恒温水浴 中也有部分水解, 所以有颜色变化, 但变化不明显。

) 从这三支试管看出蔗糖酶只对蔗糖的水解 有 催化作用,对淀粉无催化作用,具有对蔗糖的底物专一性。

3 号是对照。

七、思考题 1.观察酶专一性实验为什么要设计这 3 组实验?每组各有何意义?蒸馏水有何用? 第一组作为整个实验的空白对照组, 检测 Benedict 试剂对实验结果的颜色有何影响, 排除干扰 因素的存在。

第二组作为检测淀粉酶的专一性实验组, 第三组作为检测蔗糖酶的专一性的实验组。

蒸 馏水作为每一个组中的空白对照,与组内其余两组进行对照。

2.将酶液煮沸 10min 后,重做二、三的操作,观察有何结果? 各试管都为蓝色,因为酶在煮沸过程中 已经变性,失去催化活性,故不能催化各自对应底物的 水解反应。

3.在此实验中,为什么要用 0.5%淀粉(0.3%NaCl)溶液?0.3%NaCl 的作用是什么? 0.3%NaCl 中的 Cl 是作为激活剂激活唾液淀粉酶的活性, 使实验结果不至于因为唾液淀 粉酶的 活性不足而导致不同。

八、注意事项 1.试管要干净,所有试剂加量准确,加好试剂后要摇匀。

2.使用试剂时不要人为 造成试剂间的互相污染;试剂用好瓶盖要立即盖好,防止试剂间的互相污染。

以免实验结果的错 误。

- Ⅱ. 影响酶活性的因素——激活剂和抑制剂 一、实验目的和要求 1. 了解激活剂和抑制剂对酶促反应速度的影响 。

2. 学习检定激活剂和抑制剂影响酶促反应速度 的原理和方法。

二、实验基本原理 在酶促反应过程中,酶的活性常受某些物质的影响,有些物质能使酶的活性增加,称为激 活剂;某些物质它们并不引起酶蛋白变性,但能使酶分子上的某些必需基团(主要是指酶活性中 心上的一些基团)发生变化,因而引起酶活力下降,甚至丧失,致使酶反应速度降低,称为酶的 抑制剂。

酶的激活剂种类: 1、一些简单的无机离子,如 Mg2+、Cl-等; 2、一些中等大小的有机分子, 如抗坏血酸等也是激活剂,它们对某些含巯基的酶具有激活作用; 3、有些酶的催化作用易受某

图3

些抑制剂的影响,因而能除去抑制剂的物质也可称为激活剂,如 EDTA 能除去重金属,因而能解 除重金属对酶的抑制作用。

4、具有蛋白质性质的大分子物质,这些激活剂是指可对某些无活性 的酶原起作用的酶。

酶的抑制剂有许多种: 如重金属离子(Ag+、Hg2+、Pb2+、Cu2+等) 、 少量的激活剂或抑 CO、氯化物、H2S、砷化物、氟化物、生物碱、有机磷农药等都是抑制剂。

活剂对酶的作用是不同的。

碘作用的颜色反应如下: 制剂就能影响酶的活性,而且常具有特异性。

值得注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的,各种激 本实验利用淀粉被水解的不同阶段产物与碘有不同颜色反应, 定 性观察唾液淀粉酶在酶促反应中激活或抑制现象。

淀粉经酶促水解为葡萄糖的不同阶段的产物与 本实验中,Cl-为唾液淀粉酶的激活剂; Cu2+为唾液淀粉酶的抑制剂。

利用淀粉被水解的不同阶段产物与碘有不同的呈色反应, 定性观察唾液淀粉酶在酶促反应中 激活和抑制现象。

淀粉 + 碘 淀粉 + 淀粉酶 蓝色 水解产物 + 碘 颜色变化 水解的程度是通过水解混合物遇碘溶液所呈现的颜色之变化来判断的。

三、实验材料与试剂 1、实验材料 新鲜唾液 2、实验试剂⑴ 唾液淀粉酶(学生自制) 取唾液 1ml 至 25ml 量 筒中,用蒸馏水稀释至 25ml,用棉花过滤备用。

唾液稀释倍数因人而异,可稀释 50~400 倍, 甚至更高。

⑵ 0.1% 淀粉溶液⑶ 1.0% 氯化钠溶液⑷ 1.0% 硫酸铜溶液⑸ 1.0% 硫酸钠溶液⑹ 碘化钾-碘液四、实验器材与仪器 1.试管及试管架 2.量筒 3.漏斗 4.脱脂棉花 5.点滴板 6.吸量管 7.恒温水浴(37℃) 五、实验操 作方法和步骤 取试管 4 支,按下表操作: 注意: ⑴找出准确的保温时间,是本实验是实验能否成功的关键步骤之一,唾液淀粉酶液浓度 可根据个人情况而定,通过 37℃水浴溶保温计时,反应时间最好在 8~15min 以内,只有确定准 确的保温时间才能进行实验。

(2) 加入酶液后,务必充分摇匀,保证酶与全部淀粉液接触的

图4

反应才能得到理想的颜色梯度变化结果。

(3)碘化钾–碘液不要过早地加到点滴板上,以免碘 液挥发,影响显色效果。

六、结果分析讨论 1 号试管为蓝紫色,2 号为浅黄色,3 号为褐色,4 号为浅褐色。

试管 1 中颜色最深,说明 CuSO 4 可以抑制淀粉酶的活性;试管 2 中颜色最浅,基 本呈碘色, 故淀粉酶活性最高,说明 NaCl 可以激活淀粉酶的活性;试管 3、4 中颜色基本 一致,且深浅 居于试管 1、2 之间,淀粉酶活性一般,说明 Na+、SO 4 2- 对淀粉酶活性都没有 影响。

故总体 上看,可以得出 Cl - 是唾液淀粉酶的激活剂,Cu 2+ 是唾液淀粉酶的抑制剂。

七、思考题 1. 激活剂可分哪几类?本实验中 NaCl、硫酸铜是属于哪种类型? 激活剂可分为:简单无机离子、中等大小有机分子、能除去抑制剂的物质、具有蛋白质性质的大 分子物质等。

NaCl 属于简单无机离子;CuSO4 属于重金属抑制剂。

2. 本实验中,1,2,3,4 管各有何用意?为什么要设计第 3 管和第 4 管? 1 管可观察抑制剂对反应影响的现象,2 管可观察激活剂对反应影响的现象,第 3 管可以将 1 管 中的 Na 和 2 管中的 SO4 对反应的影响去除,4 管作为空白对照。

3. 抑制剂与变性剂有何不同?试举例说明。

抑制剂只改变酶的催化活性,并不使蛋白质变性,其影响是可逆的;变性剂破坏了蛋白质的高级 结构,使蛋白质变性,并且多数变性剂的影响是不可逆的。

如:Cu 如果将 Cu 2+ 2+ + 2- 是唾液淀粉酶的抑制剂,但 去除淀粉酶的活性又可以变为正常水平。

八、注意事项 1.试管要干净,所有试剂加 量准确,加好试剂后要摇匀。

2.使用试剂时不要人为造成试剂间的互相污染,以免实验结果的错 误。

3.试剂用好瓶盖要立即盖好,防止试剂间的互相污染。

4.两种淀粉不要弄错。

5.激活剂抑制 剂实验中,注意运用点滴板(显色板)来控制保温时间; 如 1,2,3,4 管颜色反应无明显差别, 可能是唾流淀粉酶活力太高或太低,若酶活性太高可将酶稀释后重做;若酶活性太低,可延长保 温时间或增加酶的浓度。

Ⅲ. 影响酶活性的因素——温度,最适温度测定 一、实验目的和要求 1. 了解温度对酶活力的影响;2. 学习测定最适温度的原理和方法; 二、实验基本原理 酶的催化反应受温度影响很大,每一种酶所催化的反应,在一定条件下,仅在某一温度范 围内表现出最大的活力,即反应速度最大时的温度,这个温度称为该酶促反应的最适温度,高于 或低于最适温度时,反应速度逐渐下降。

因此,酶促反应与温度的关系,用酶活力对温度作图, 通常具有钟罩形曲线特征。

温度与酶活力的关系测定是选择一定的条件,把底物浓度、酶浓 度、反应时间、pH 等固定在最适状态下,然后在一系列不同温度条件下,进行反应初速度测定, 以酶反应初速度对温度作图,可以得一个钟罩形的曲线,即为温度—酶活性曲线,在某温度有一 酶活力最大值,这个温度即为最适温度。

实验①利用唾液淀粉酶为试验对象,在 0℃~65℃之间选择不同的温度,进行酶活力测定。

根据淀粉被唾液淀粉酶水解的程度的不同,遇碘呈现颜色的变化来判断酶活力的大小及最适温 度。

实验②采用蔗糖酶为试验对象,在室温至 75℃之间选择不同温度进行酶活力测定。

蔗 糖酶的活力常以其反应产物还原糖(葡萄糖)的生成量来表示。

测定还原糖的方法很多,本实验 选择 3,5–二硝基水扬酸法测定还原糖量。

在碱性条件下,3,5–二硝水杨酸与还原糖溶液共热 后被还原成红色氨基化合物, 并在一定浓度范围内, 还原糖的量与反应溶液所呈棕红色物质颜色

图5

的深浅程度成正比。

因此,可以用分光光度法测定酶促反应后生成的还原糖量,从而测定蔗糖水 解的速度和酶活力。

三、实验材料与试剂 1、实验材料⑴ DNS)试剂⑷ 蔗糖酶液(样品Ⅳ)加蒸馏水适当稀释,备用;⑵ 5%蔗糖(A.R.)溶液(W/V)⑶ KI-I2 溶液 4.滴管, 5.点滴板,6.分光光度计, 7.制 取 5 支试管,按下表操作。

0.5%淀粉溶液(含 0.3%NaCl)⑸ 新鲜唾液。

2、实验试剂⑴ 3,5—二硝基水扬酸(简称 0.2mol/L 醋酸缓冲液(pH4.6)⑵ 四、实验器材与仪器 1.试管及试管架, 2.恒温水浴, 3.吸量管, 冰机。

五、实验操作方法和步骤 一、温度对唾液淀粉酶活力的影响 1.观察温度对酶活动的影响: 注意: ⑴找出准确的保温时间,是本实验是实验能否成功的关键步骤之一,唾液淀粉酶液浓度 可根据个人情况而定,通过 37℃水浴溶保温计时,反应时间最好在 8~15min 以内,只有确定准 确的保温时间才能进行实验。

(2)加入酶液后,务必充分摇匀,保证酶与全部淀粉液接触的反应 才能得到理想的颜色梯度变化结果。

(3) 碘化钾–碘液不要过早地加到点滴板上, 以免碘液挥发, 影响显色效果。

⑷各管保温时间要相同。

2、绘制温度-酶活力曲线图,以反应温度为横坐标,反 应液颜色的深浅程度(代表酶活力的大小)为纵坐标。

绘制温度——酶活力曲线(钟罩形) ,确 定唾液淀粉酶的最适温度。

二、温度对蔗糖酶活力的影响 1、蔗糖酶最适温度的测定 取试 管 7 支进行编号,0 号管为空白对照,以蒸馏水代替酶液,1—7 号顺序为测定管,向各管加入 0.2mol/L 醋酸缓冲液(pH4.6)1ml, 2%蔗糖溶液 0.5ml,然后将各编号管依次放入相应温度(见 下表)的恒温水浴或恒温箱中,预热 2min,再逐管准确计时加入 0.5ml 经适当稀释的蔗糖酶液, 迅速混匀;精确反应 10min 后,加入 1ml 3,5–二硝基水杨酸(DNS)试剂,立即混匀,放入沸 水浴中加热 5min。

取出用流水冷却至室温后,向各管加入 5ml 蒸馏水,充分混匀。

以 0 号管作 空白对照 A520 值为零,在分光光度计上于 520nm 波长处测定各管的 A520 值,并作好记录。

2、 绘制温度——酶的活力曲线图 以反应温度为横坐标,相应的 A520(表示反应初速度)为纵 坐标,绘制出温度—酶活力(A520 值)曲线图,从而可以测出蔗糖酶在本实验条件下的最适温

图6

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